3 | P á g i n a
homogeneización se hizo en el Fastprep 5G.
Terminado el proceso, el ADN fue secado a
temperatura ambiente por 2 horas y se
resuspendió en 150 µl de tampón T10E1. La
digestión con ARNasa se realizó una vez que el
ADN estuvo completamente resuspendido en
T10E1; se agregó 3 µl de ARNasa a cada
muestra y se incubó a 37 ºC durante 1 hora y
media. El ADN extraído se cargó en gel de
agarosa al 1% y se realizó la electroforesis a 90
voltios por 1 hora. Los geles se prepararon con
agarosa (al 1%, grado molecular) y tampón
TBE 1x. Se utilizaron moldes medianos con
capacidad para 2 peines de 20 pozos. Previo a
cargar las muestras al gel, se mezcló 1.5 µl de
ADN con 10 µl del tinte (sab 1X: Gel red, 1:5),
la calidad del ADN se valoró por observación
de las bandas (forma y grosor). La forma nos
indicó cuán íntegro estaba el ADN; bandas
difusas o presencia de un barrido indicó que el
ADN estaba degradado. El grosor indicó
cuánto de ADN había sido extraído,
comparándose con controles de peso conocido
100, 200, 400 pb. En aquellos casos donde se
observaron rastros difusos de ARN (smear), las
muestras se volvieron a digerir con ARNasa. El
ADN extraído se cuantificó con el equipo
Epoch cargándose 2 µl del blanco (tampón
T10E1) y 2 µl de muestra (con repetición); la
absorbancia del espectrofotómetro estuvo a
230, 260 y 280 nm, dándonos la concentración
de la muestra en ng/µl; el software Gen5
registra los resultados del Epoch en un archivo
Excel. Se calculó el promedio de las 2
repeticiones y se dividió entre 3 (factor de
corrección) para determinar la concentración
de las muestras. Las muestras se diluyeron con
agua libre de nucleasas hasta alcanzar una
concentración de 5 ng/µl, volumen de 180 µl en
placas de PCR de 96 pocillos (CIP. 2004).
El método de amplificación PCR se usó 12 de
los 24 marcadores micro satélites que
conforman el set de Identificación Genética de
(CIP, 2004; Ghislain et al., 2004, 2009;
Ashkenazi et al., 2001). Se siguió los
programas de amplificación estandarizados de
acuerdo a la temperatura óptima de unión de
cada iniciador a la región flanqueante del
microsatélite (Ghislain et al. 2004, 2006, 2009,
Spooner et al. 2007, De Haan et al. 2013). Se
repartió 5 µl de “Master Mix” en una placa para
PCR de 96 pocillos y se adicionó 5 µl de ADN
(concentración de 5 ng/µl). Los procesos se
realizaron sobre hielo para evitar degradación
del ADN y los reactivos sensibles al calor. Las
muestras de ADN de las papas nativas se
amplificaron en un volumen final de 10 µl
(CIP, 2004). Terminada la amplificación, se
agregó 5 µl del tampón de carga Blue Stop
Solución a cada pocillo de la placa y se cubrió
con papel aluminio para que la luz no degrade
los fluoróforos, los cuales marcaron los
fragmentos amplificados. La detección se los
segmento de amplificados de ADN, se detectó
con el método de poliacrilamida 6%; urea 7M,
y una tinción con nitrato de plata (CIP 2004).
El software de análisis SAGA GT registró los
alelos SSR; tomó en cuenta aquellas bandas
que mostraron una morfología definida
(Ghislain et al., 2004, 2009). Se registraron los
datos de los diferentes alelos en una matriz
binaria: a los presentes se les asignó el valor de
1 y a los ausentes el valor de 0. Cuando las
muestras no presentaron amplificación en SSR
dado, estas se consideraron como datos
perdidos y se asignó el valor 9 para todos los
alelos encontrados para ese SSR en las demás
muestras (Ghislain et al., 2004, 2009). Al final
el programa reportó tamaños de alelos de un
microsatélite encontrados por muestra. Este
reporte se transfirió a un archivo Excel para
generar la matriz de unos y ceros. A partir de
los resultados moleculares, se construyó la
matriz básica de datos moleculares “MBDmo”
“doble estado”; se analizó su similitud y
construyó el dendográma, se calculó la matriz
cofenética y su correlación en cada punto (test
Mantel) (Soto, 2006).
c. Fase de gabinete
El trabajo de gabinete fue realizado en las
instalaciones de la Universidad Nacional de
Huancavelica, julio del 2020 a marzo 2023. Se
utilizó, el paquete de software NTSYSpc 2.2
(Rohlf, 1998) para calcular la distancia
genética y construir el dendográma. También
se utilizó el software Arlequin 3.5.2.2, para
analizar estadísticamente el número de alelos,
la frecuencia de haplotipos y el análisis de
varianza molecular (análisis no paramétrico
AMOVA) (Gonzales, 2016).
3. RESULTADOS
3.1. COLECCIÓN DE PAPAS NATIVAS
Se colectó 131 cultivares de papa nativa en tres comunidades de la Región Huancavelica “Santa Cruz
de Paccho Molinos, Chanquil y Huayanay”, se instaló las colectas en cada comunidad (Tabla 1).
3.2. PERFIL GENÉTICO DISTINTIVO DE CADA CULTIVAR